利用多重实时PCR NAD检测方法定量检测受污染的高纯水相关的常见人类细菌病原体


  高纯水（HPW)可能被人类病原微生物感染。因为HPW通常用于工业，制药和临床邻域。这种生物污染可能对人类健康构成风险。ElizabethMinoguel,Nina L Tuite等人据实时定量PCR实验发布的最低信息设计和优化了一种新型内部控制的5重实时PCR核酸诊断检测（NAD)，以快速检测、鉴定和量化嗜麦芽狭窄单胞菌、伯克霍尔德菌属、铜绿假单胞菌和粘质沙雷氏菌这些通常与水和配水系统的生物污染有关的人类致病菌。
  人类细菌病原体微生物对HPW的污染是一个不容小觑的问题，在医院环境，接触微生物污染水可导致患者发病率和死亡率的增加；在工业环境中，水和HPW的微生物污染会导致制造设备的生物恶化，严重损害工业原材料和成品的质量。使用传统的平板计数微生物培养方法对水污染相关微生物进行检测时，无法在培养基上形成菌落，这些活的但不可培养的细菌可能无法被标准的微生物培养检测到。
  核酸诊断（NAD)技术在实时分析与HPW分布系统相关的微生物生物污染的发生和进展上极富潜力。Elizabeth Minoguel,Nina L Tuite设计和开发了一种内部控制的多重实时PCR NAD检测方法，用于实验室条件下生物污染HPW中这些GNB-NE的定量检测和鉴定。该研究使用到了10种狭窄滋养单胞菌种/菌种，26种伯克霍尔德菌属，10种假单胞菌属/菌株和1种沙雷氏菌属/菌株。使用到的核酸诊断靶基因包括ssrA,lepA,rnpB,16SrRNA和基因以及16-23SrRNA ITS。对各菌株充分培养之后进行DNA分离定量，获得DNA样品。随后PCR扩增狭窄滋养单胞菌和沙雷氏菌属的ssr基因和伯克霍尔德菌的rnpB基因，扩增得到的PCR产物纯化后进行核酸诊断靶点测序。扩增引物概述于表1

  根据实时定量PCR实验发布的最低信息设计和优化了一种新型内部控制的5重实时PCR核酸诊断测试（NAD),以快速检测、鉴定和量化嗜麦芽狭窄滋养单胞菌、伯克霍尔德菌属、铜绿假单胞菌和粘质沙雷氏菌这些通常与水和配水系统的生物污染有关的人类致病菌。其研究工作包括诊断目标识别和开发、多重实时诊断检测的特异性测试、多重实时荧光定量PCR NAD检测的分析灵敏度测试、定量限（LOQ）测试。
  快速定量多重实时荧光定量PCR NAD测定来分析水和HPW中的微生物污染，可以潜在地克服传统上用于监测水质的基于传统培养的微生物诊断技术相关的一些限制，如得出分析结果需要时间较长、可能无法培养出所有存在的污染微生物。而使用5 重 PCR NAD 测定不需要对 HPW 样品进行微生物培养预富集以提高在运行诊断测定之前的分析灵敏度。这种无需微生物培养预富集即可检测污染微生物的能力是一个显着的优势,另一个主要优点是测定TAT显着降低,包括HPW采样和过滤、DNA制备、实时PCR反应和数据分析在内的TAT结果<5小时。使用NAD技术（例如实时PCR分析水中的微生物污染）缺点在于可能会导致从死亡微生物中检测DNA，因此存在高估微生物污染或假阳性结果的风险。水样中存在来自病原微生物的任何DNA都表明系统内存在生物污染。配水系统中任何病原微生物的污染即使浓度低，也应该纳入检测。
  研究中描述的新型培养物独立方法允许从生物污染的水和HPW分配系统中快速（<5小时）定量检测和鉴定这四种人类病原体。可以将所描述的NAD测定和相关方法应用于水和HPW分配系统的常规测试，以确保微生物安全性和高水质标准。