前沿研究
在水质中检测诺如病毒基因I株的实时RT - PCR法
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日期：2023.11.02
属于：前沿研究
诺如病毒(NoVs)是全球急性胃肠炎(AGE)暴发的主要来源，Cho HG等人开发了一种新型探针JJV1PM，用于RT-qPCR检测NoV基因组(G) I株。使用JJV1PM探针的RT-qPCR检测对10种基因型的NoV GI显示出广泛的菌株反应性。
NoVs是一类遗传多样性的单链RNA病毒，将NoVs分为7个不同的基因组(G) I至VII，其中NoV GI与约10%的NoV暴发有关。对于已有NoV GI的检测，传统的RT-PCR检测既耗时又繁琐，酶免疫分析(EIAs)方法不够灵敏。该实验采用的实时RT-qPCR 检测方法与传统的RT-PCR检测相比，增加了靶向性DNA探针的应用，使得这种改进的方法具有更广泛的菌株反应性。此外，它对含有NoV GI菌株的水样表现出更加明显的效果。
为了测试改进的RT-qPCR法的性能，收集水样和粪便样本，经过DNA提取，对粪便样本，采用靶向C区的半巢式RT-PCR方法进行NoV基因分型，鉴定样本中NoVs的基因型(表1)；对于水样，克隆到pGEM-T Easy载体中将质粒被纯化然后测序。为了区分探针修饰的效果(表1)，RT-qPCR实验中使用了相同的正向和反向引物，获得的所有数据在交叉阈值(Ct)值为40的阈值内进行分析。
为了获得NoV GI菌株中准确的探针靶区，从存档的10个NoV GI基因型中计算反映探针-靶区的10个核苷酸(nt)序列，进行序列比对，以确定RT-qPCR探针与NoV GI菌株靶区的核苷酸差异。比对分析显示，对于所测7株不同基因型NoV GI菌株，JJV1PT和JJV1PM探针的靶区完全匹配(图1)。然而，JJV1PM探针在GI.3、GI.8和GI.12菌株的探针-靶区具有单核苷酸多态性(SNP)，存在两个核苷酸不匹配的情况(图1)。
图 1用RTqPCR探针检测NoV - GI菌株的靶区序列比对
由于JJV1PM探针具有较高的应变反应性，该实验分别使用JJV1PM探针、JJV1PT探针法对水样进行了NoV GI菌株检测，JJV1PM探针法在水样中检出样本量明显高于JJV1PT探针法(表3)。基因型分析显示，改进后的JJV1PM探针法检测到7个基因型，而JJV1PT探针法仅检测到2个基因型(表3)。在水样中，JJV1PT探针法检测到NoV GI.2和GI.4菌株，JJV1PM探针法检测均没有结果(表3)。
经验证，JJV1PM探针检测方法具有较高的特异性和更广泛的菌株反应性。并成功应用于水传播型NoV GI菌株的检测。由于NoV GI菌株是水传播或食源性AGE暴发的重要病原菌，因此该实验改进的RT-qPCR检测将对预防NoV GI相关AGE暴发具有重要作用。
原始出处：Detection of waterborne norovirus genogroup I strains using an improved real time RT-PCR assay
NoVs是一类遗传多样性的单链RNA病毒，将NoVs分为7个不同的基因组(G) I至VII，其中NoV GI与约10%的NoV暴发有关。对于已有NoV GI的检测，传统的RT-PCR检测既耗时又繁琐，酶免疫分析(EIAs)方法不够灵敏。该实验采用的实时RT-qPCR 检测方法与传统的RT-PCR检测相比，增加了靶向性DNA探针的应用，使得这种改进的方法具有更广泛的菌株反应性。此外，它对含有NoV GI菌株的水样表现出更加明显的效果。
为了测试改进的RT-qPCR法的性能，收集水样和粪便样本，经过DNA提取，对粪便样本，采用靶向C区的半巢式RT-PCR方法进行NoV基因分型，鉴定样本中NoVs的基因型(表1)；对于水样，克隆到pGEM-T Easy载体中将质粒被纯化然后测序。为了区分探针修饰的效果(表1)，RT-qPCR实验中使用了相同的正向和反向引物，获得的所有数据在交叉阈值(Ct)值为40的阈值内进行分析。
表 1用于半巢式RT-PCR和RT-qPCR检测诺如病毒GI株的寡核苷酸
为了获得NoV GI菌株中准确的探针靶区，从存档的10个NoV GI基因型中计算反映探针-靶区的10个核苷酸(nt)序列，进行序列比对，以确定RT-qPCR探针与NoV GI菌株靶区的核苷酸差异。比对分析显示，对于所测7株不同基因型NoV GI菌株，JJV1PT和JJV1PM探针的靶区完全匹配(图1)。然而，JJV1PM探针在GI.3、GI.8和GI.12菌株的探针-靶区具有单核苷酸多态性(SNP)，存在两个核苷酸不匹配的情况(图1)。
图 1用RTqPCR探针检测NoV - GI菌株的靶区序列比对 改进后的RT-qPCR(以下简称JJV1PM探针法)对NoV GI株和原JJV1PT探针法均具有特异性(表2)。对10株NoV GI株、12株NoV GII株、3个A组轮状病毒样本、3个星状病毒样本、3个肠道腺病毒样本和3个粪便样本进行验证测定。
表 2 RT-qPCR检测NoV株和其他肠道病毒的验证
由于JJV1PM探针具有较高的应变反应性，该实验分别使用JJV1PM探针、JJV1PT探针法对水样进行了NoV GI菌株检测，JJV1PM探针法在水样中检出样本量明显高于JJV1PT探针法(表3)。基因型分析显示，改进后的JJV1PM探针法检测到7个基因型，而JJV1PT探针法仅检测到2个基因型(表3)。在水样中，JJV1PT探针法检测到NoV GI.2和GI.4菌株，JJV1PM探针法检测均没有结果(表3)。
表 3采用RT-qPCR方法比较含有NoV GI基因型的水媒样品的检测Ct值
经验证，JJV1PM探针检测方法具有较高的特异性和更广泛的菌株反应性。并成功应用于水传播型NoV GI菌株的检测。由于NoV GI菌株是水传播或食源性AGE暴发的重要病原菌，因此该实验改进的RT-qPCR检测将对预防NoV GI相关AGE暴发具有重要作用。原始出处：Detection of waterborne norovirus genogroup I strains using an improved real time RT-PCR assay
