基于ATP生物发光法的微生物快速检测技术

1.ATP生物发光法的主要原理
在有氧环境中，荧光素在荧光素酶、Mg2+的催化作用下与ATP发生反应生成荧光素-AMP复合体并释放出焦磷酸；荧光素-AMP复合体在O2的作用下，进一步生成氧化荧光素并释放出CO2、H2O和AMP；最终，激发态的氧化荧光素回归基态发出光子(下图)，光子数量可换算成ATP的含量。
2. ATP生物发光法检测步骤
样品中ATP的提取、荧光素-荧光素酶溶液的添加与反应、生物发光值检测3个部分，通过ATP生物发光法标准曲线计算，进而反映样品中微生物的量。
3. ATP生物发光法影响因素
ATP生物发光法的主要反应物质包括荧光素、荧光素酶和ATP提取剂。尽管ATP生物发光法具有操作简便、反应迅速和灵敏度高的优点，但其检测灵敏度易受到诸多因素的影响。
3.1非微生物ATP的影响
ATP生物发光法主要应用于测定微生物的量，而待测样品中的非微生物ATP，如游离ATP及动物体细胞中的ATP是影响测量结法果准确性的主要因素。Pavankumar等开发了一种重组Shigella flexneri Apyrase (RSFA)，并与5种商业化酶(马铃薯脱酪酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、己糖激酶和甘油激酶)的ATP消耗潜力进行了对比，结果显示，RSFA可完全消除细胞外ATP和ATP的复合物，甚至在尿液和血清等生物样本中也显示出优越的活性。
3.2 微生物量的影响
样品中的细菌数量是影响ATP生物发光法测量准确性的重要因素之一。研究证实，ATP扩增技术具有灵敏度高与快速检测的优点，可有效克服样品中微生物ATP含量低而导致检测结果不准确的难题。ATP扩增技术有两条扩增路线，即焦磷酸(PPi)扩增与AMP扩增(图2)。
图2 ATP扩增路线ADK：腺苷酸激酶；PEP：磷酸烯醇丙酮酸；PK：丙酮酸激酶；ATPS:ATP硫酸化酶；APS：腺苷酰硫酸
3.3ATP提取剂的影响
ATP生物发光法中的ATP提取剂主要有以下特点：(1)可快速杀死活细胞并破碎细胞膜以获得最大ATP的量；(2)使ATP水解酶(Apyrase)失活并且不影响ATP的性质；(3)不影响或轻微影响荧光素酶的活性。
3.4荧光素酶活性的影响
当前，无论基于何种荧光素的发光体系，其催化反应都是由ATP、荧光素酶、荧光素、二价金属离子等共同完成，荧光素酶的催化起主要作用。因此，优化荧光素酶的反应条件是必要的。目前已知的荧光素酶活性影响因素包括离子浓度、p H、温度及制备方法等。
4.ATP检测设备的结论与展望
目前，ATP生物发光法已在食品、医疗、卫生消毒及生态环境科学等领域中微生物的检测方面获得了广泛发展与应用，在食品安全、医疗消毒与废水处理效果评价方面发挥了重要作用。
尽管该方法对于微生物的检测具有快速、灵敏、广谱等优点，但其易受到各种因素(样品性质、荧光素酶活性与稳定性、提取剂与解抑制剂等)的影响，检测结果的准确性仍存在挑战。
为提升ATP生物发光法检测结果的准确性与适用性，以下几方面的问题值得关注：
(1)整个ATP生物发光法检测体系中，荧光素酶各试剂间的相互作用对检测结果影响较大，然而目前的研究主要集中在对单一提取剂或荧光素酶的优化与调整方面。因此，在今后的研究中，应根据样品的性质与特征，更加注重整个ATP发光反应体系中提取剂、解抑制剂、荧光素酶活性等的有机组合与优化，以进一步提高检测的准确性与灵敏度。
（2）对于微生物含量较少的样品，现有的ATP扩增技术基本能满足检测要求，但ATP扩增技术本身存在内源性污染从而产生背景干扰，今后需根据内源性污染产生的来源采取相关措施解决背景干扰的问题。
（3）目前各行业针对微生物数量检测缺乏明确的计量体系，同时不同检测设备的检测限度存在差异，而且实际应用中均需要与平板计数法等标准计数法进行比对，效率较低。因此，未来各行业可根据实际情况推行单独的行业计量体系。