检测食品中病原体的联合检测法

  Sara Asgari团队将拉曼光谱(SERS)光流控传感器与免疫探针结合，对大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌等进行分离检测，实现在食品样品中高效率、高灵敏度地检测多种病原体。
  当多种细菌病原体以不同浓度共存于同一食品样品中，培养和生化测试等传统检测方法准确但费时费力。基于表面增强拉曼光谱(SERS)的光流体系统由于其高灵敏度和快速性、再现性、可控性和实时监测以及更有效的传感和检测分析等优点在新兴的分析设备中脱颖而出。此项研究将SERS光流控传感器与免疫分析法结合，在流动聚焦流体动力微流控芯片中同时检测多种危险食源性病原体。
  该方法包括三个步骤:(1)富集以提高检测灵敏度，(2)通过携带特定抗体的sersnanotag对目标细菌进行选择性分离和标记，(3)在流体动力学流动聚焦SERS光流装置中使用SERS检测标记的细菌细胞。首先将细菌细胞在42℃下不同的时间间隔分别进行富集，目的是确保在食品样品中检测到极低计数的细菌。富集后，将目标细菌病原体通过其特异性SERS纳米标签从样品中分离，未反应试剂通过多次离心和洗涤步骤被去除。分离后标记的细菌细胞随后流过SERS光流装置，在拉曼激光照射下检测拉曼报告细胞(具有不同的SERS信号)，目标细菌病原体的存在表明食品样品受到目标病原体的污染。流体动力学流动聚焦SERS光流控传感器可以检测到样品流中非常低浓度的细菌细胞，从而实现对食品样品中多种细菌病原体的高灵敏度和高效率检测。
  图1展示了本研究中使用的SERS纳米标签的制作过程示意图
图1 GNP@R6G@SA@Ab和GNP@FL@SA@Ab sers纳米标签的制备工艺
表 1本实验所使用菌株
  通过紫外可见光谱对SERS纳米标签的成功制备进行评估(图2)。图 2GNP@R6G@SA@Ab和GNP@FL@SA@Ab sers纳米标签的紫外可见光谱
  从食品样品中分离致病菌初步评估结果表明，原生菜和包装沙拉样品不含目标致病菌。利用扫描电镜(SEM)成像和共聚焦显微镜分别评估SERS纳米标签在细菌细胞上单独或在细菌混合物中固定的效率。如图3所示，大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌细胞通过抗原-抗体相互作用被几个特异性SERS纳米标签成功锚定。由于多克隆抗体使SERS纳米标签占据细胞表面抗原位点的不同区域，因此SERS纳米标签附着在细菌细胞的不同区域。图 3大肠杆菌O157:H7 (A)和沙门氏菌细胞(B)分别由GNP@R6G@SA@Ab和GNP@FL@SA@Ab sers纳米标签固定的SEM图像。
  共聚焦显微镜获得的图像中(图4)，SERS纳米标签被选择性地附着在它们的特定靶标上。图 4由特定sers纳米标签固定的细菌鸡尾酒的共聚焦显微镜图像。(A)大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌细胞图像 (B)GNP@R6G@SA@Ab纳米标签捕获的大肠杆菌O157:H7细胞 (C)GNP@FL@SA@Ab纳米标签捕获的沙门氏菌细胞。
  本设计中，样品流经两个中性侧流之间的中心流，然后在T型区后的某一点暴露于拉曼激光下，在此检测和识别目标分析物。这种模式使样品更容易受到拉曼激光的照射，从而提高了即使是极少量目标分子或痕量的目标分析物的SERS可探测性。图 5 SERS光流控传感器示意图 以及光流SERS器件的T型区
  R6G和FL的主要拉曼峰列于表2。其中，1358和1510 cm-1和1183和1637 -1的峰分别被认为是R6G和FL最具特征的拉曼波段。据推测，从食品样品中大肠杆菌O157:H7和致病性沙门氏菌的细菌混合物中获得的拉曼信号中，成功的分离和检测应该至少显示出这四个峰。
表 2 R6G和FL的特征拉曼波段  图6显示了R6G、GNP@R6G@SA@Ab、FL和GNP@FL@SA@Ab的特征拉曼光谱。每个SERS纳米标签的主峰代表其拉曼报告分子的指纹状拉曼光谱。图 6（A) R6G、GNP@R6G@SA@Ab特征拉曼光谱（B) FL、GNP@FL@SA@Ab特征拉曼光谱
  图7显示了从生菜和沙拉样品中获得的拉曼光谱，四个最突出的目标峰值在所有信号中都可以检测到。图 7在不同浓度(1000、100和10 CFU/ 200 g样品)下，对生菜(A-C)和袋装沙拉(D-F)样品进行加标，获得SERS光谱。橙色三角形表示标记的大肠杆菌细胞的拉曼峰(1361和1509 cm-1)，绿色圆圈(1184和1638 cm-1)表示标记的沙门氏菌细胞的拉曼峰。A、D = 15 min, B、E = 30 min, C、F = 45 min。
  为了确保来自细菌本身或PDMS微流控装置的峰值不会干扰我们的结果，我们用拉曼检测了纯细菌培养物和PDMS(图8)。图 8 PDMS、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌细胞的拉曼光谱。
  表3列出了在不同孵育时间后生菜和包装沙拉中同时检测大肠杆菌O157:H7和致病性沙门氏菌的结果。根据研究结果，我们的方法在两种食品样品中富集15分钟后都能检测出1000、100和10 CFU/ 200 g的细菌鸡尾酒样品。证明了SERS方法检测食品样品中多种病原体的高灵敏度。
表 3SERS光流联合免疫分析法同时检测生菜和袋装沙拉中大肠杆菌O157:H7和致病性沙门氏菌的检测性能  该研究将免疫探针与SERS光流控传感器相结合，对致病性大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌进行选择性分离检测。该方法能检测出食品样品中极低浓度的的细菌混合物，并且检测时间显著缩短至2 h以内。通过开发含有针对特定病原体的更特异性或选择性抗体的SERS纳米标签，可进一步提高该技术的特异性。
原始出处：Duplex detection of foodborne pathogens using a SERS optofluidic sensor coupled with immunoassay